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2023年4月4日方东实验室在Genome Research杂志发表论文发现Tn5转座酶片段化并标记单链DNA的活性

时间:2023年04月11日 访问次数:10

DNA高通量测序技术被广泛应用于生命科学研究中,是基因表达分析,遗传组学分析,表观遗传组学分析等多种组学研究的必要手段和方法。在使用二代高通量测序技术时,传统建库方法通常使用超声打断或酶消化的方式将目标DNA片段化,之后通过连接反应将特定序列引物连接到片段化DNA上,进而PCR扩增得到测序文库[1]

自Tn5转座酶在大肠杆菌中发现以来,多被用于片段化并标记双链DNARNA/DNA杂交链[2]转座酶能在片段化目标DNA的同时将转座子DNA插入目标序列,从而产生可以直接PCR扩增建库的DNA片段[3,4](图1)。与传统方法相比,合并了DNA打断和接头连接的过程,大大缩短了建库时间并提高了文库构建效率。因此,Tn5应用于多种高通量测序方法。

202344日,永利yl23411官网登录方东实验室在Genome Research杂志发表题为“Tn5 tagments and transports oligos to single-strand DNA for strand-specific RNA sequencing”的论文,提出了Tn5转座子可片段化并标记单链DNA的功能,并在此基础上开发了具有链特异性的单链DNA测序方法(图1


 

1. Tn5可以切割多种形式的核酸序列

图中以翻花绳比如Tn5对核酸的切割。两个小朋友比喻两个Tn5蛋白,花绳象征不同形式的核酸分子。


为探究Tn5如何作用于不同的核酸底物,研究者以双链DNA,单链DNARNA链,DNA/RNA杂交链分别作为底物进行实验,发现Tn5可以片段化单链DNA。机制探索发现Tn5转座子在转座单链DNA时,将转座子DNA插入单链DNA5’。研究者据此开发了一种新的单链DNA的链特异性高通量测序方法,命名为TABLE-seq (a tagmentation-based and ligation-enabled single-strand DNA sequencing method)

研究者设计了特殊的3’DNA接头,用于连接到Tn5转座子片段化后的单链DNA3’端。该特殊设计的接头的由两条寡聚核苷酸链退火组装而成:一条DNA链的5’增加磷酸化修饰,用于连接单链DNA;另一条互补链的3’端包含6延伸的随机DNA碱基,增加与目标DNA互补配对效率,并且在末端再添加一个反向dT碱基,以防止错误延伸。该特殊设计的接头连接到Tn5切割后的单链DNA3’端,从而得到双端具有特异序列接头的单链DNA模板,之后可通过PCR扩增得到链特异性的DNA文库,用于高通量测序。

在此基础上,课题组将该技术应用于常用的链特异性RNA高通量测序。使用RNA反转录后的单链cDNA为起始底物,通过TABLE-seq方法构建测序文库。相比于传统的dUTP-seq测序方法,此方法无需UDGase消化第二链模板,即可得到链特异性的扩增模板。两种测序方法对比实验显示,TABLE-seq方法可以检测到更多的基因,且具有更高的链特异性,同时测序结果在基因区域的分布更加均匀。

本研究发现并利用了Tn5转座子片段化并标记单链DNA的活性,开发了新的单链DNA链特异性测序方法了Tn5转座子在高通量测序中的应用。

永利yl23411官网登录博士研究生张燕君、唐寅为本文共同第一作者方东研究员为本文通讯作者

 

参考文献

[1] Oyola SO, Otto TD, Gu Y, Maslen G, Manske M, Campino S, Turner DJ, Macinnis B, Kwiatkowski DP, Swerdlow HP et al. 2012. Optimizing Illumina next-generation sequencing library preparation for extremely AT-biased genomes. BMC Genomics 13: 1.

[2] Sun Z, Tang Y, Zhang Y, Fang Y, Jia J, Zeng W, Fang D. 2021b. Joint single-cell multiomic analysis in Wnt3a induced asymmetric stem cell division. Nat Commun 12: 5941.

[3] Adey A, Morrison HG, Asan, Xun X, Kitzman JO, Turner EH, Stackhouse B, MacKenzie AP, Caruccio NC, Zhang X et al. 2010. Rapid, low-input, low-bias construction of shotgun fragment libraries by high-density in vitro transposition. Genome Biol 11: R119.

[4] Hennig BP, Velten L, Racke I, Tu CS, Thoms M, Rybin V, Besir H, Remans K, Steinmetz LM. 2018. Large-Scale Low-Cost NGS Library Preparation Using a Robust Tn5 Purification and Tagmentation Protocol. G3 (Bethesda) 8: 79-89.


        原文链接:https://genome.cshlp.org/content/33/3/412.full


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